类器官技术揭开宫颈鳞状细胞癌免疫微环境的高分辨异质性

2023年10月，武汉华中科技大学同济医学院附属协和医院的吴鹏教授团队在期刊EBioMedicine（IF:11.1000）发表了一篇题为“Single-nucleus RNA sequencing reveals heterogenous microenvironments and specific drug response between cervical squamous cell carcinoma and adenocarcinoma”的文章。

宫颈鳞状细胞癌（CSCC）和腺癌（CAde）是宫颈癌（CC）的两种主要病理类型，但它们的肿瘤和免疫微环境的高分辨异质性仍然难以捉摸。本项研究描述了CSCC和CAde之间的免疫异质性和特异性细胞相互作用，这为揭示发病机制和设计个性化治疗提供了启示。

对 5 个 CSCC 和 3 个 CAde 样本进行了单核 RNA 测序（snRNA-seq），并系统地勾勒出了它们的特定转录组图谱。

主要结果

Results

CSCC 和 CAde 的单细胞转录组图谱

通过单细胞RNA测序技术，研究人员发现CSCC和CAde之间存在显著的转录组异质性差异。具体而言，CSCC中的CD8+ T细胞具有更高的细胞毒性，但相对于CAde中的CD8+ T细胞，其疲劳程度更低。此外，CSCC中富含具有前瘤性的癌相关肌成纤维细胞（myoCAFs）和癌相关血管成纤维细胞（vCAFs），这些细胞在促进肿瘤转移方面发挥着重要作用。

图1 构建宫颈鳞状细胞癌（CSCC）和腺癌（CAde）组织的单细胞表达图谱。(a) 研究设计和流程图。(b) 基于 snRNA-seq 的 t 分布随机邻接嵌入（tSNE）图显示了宫颈组织的九种主要细胞类型。(c）点阵图显示了已识别细胞类型中标准标记物的归一化表达水平。(d) 按单个样本着色的所有已识别单细胞的 t-SNE 图。(e）细胞类型在每个个体样本（左）和病理类型（右）中的比例。(f）上皮细胞拷贝数变异（CNV）推断。上图展示了基于血管内皮细胞（1000 个细胞）推断出的单细胞大规模 CNV。下图显示根据上皮细胞（20% 上皮细胞）推断出的单细胞大规模 CNV。(g）小提琴图显示了每个上皮细胞亚簇的 CNV 得分。(h) 每种已识别细胞类型的细胞周期状态。

CSCC 和 CAde 中 T 细胞和巨噬细胞亚群的不同比例和功能状态

研究发现，T细胞和巨噬细胞是肿瘤微环境中的主要成分，对于抗肿瘤反应起着至关重要的作用。研究人员进一步分析了CSCC和CAde中T细胞和巨噬细胞亚群的比例和功能状态的异质性。具体而言，T细胞根据其标记基因被分为七个亚群，包括T_CD8+、T_naive、T_reg、T_ex、T_nk、T_eff和T_prolif。研究发现，CSCC和CAde中T细胞亚群的比例和功能状态存在显著差异。此外，巨噬细胞亚群也存在差异，CSCC中富含具有吞噬作用的MRC1+巨噬细胞，而CAde中则富含具有免疫抑制作用的巨噬细胞。

图2 CSCC 和 CAde 中 T 细胞和巨噬细胞的特征和功能状态。(a-b）T细胞的t-SNE图，分别按细胞类型和单个样本着色。(c) 热图显示了每个已确定的 T 细胞亚簇中标记基因的表达谱。(d）方框图显示 CSCC 和 CAde 中各 T 细胞亚簇的组成比较。P值通过Wilcoxon秩和检验计算。(e) Violin图描述了已识别的T细胞亚簇中不同功能状态的估计得分。∗P < 0.05，∗∗∗P < 0.001。P值通过Wilcoxon秩和检验计算。(f) 框图显示了 CSCC 和 CAde 中 CD8+ T 细胞的细胞毒性（左）和衰竭（右）得分。∗∗∗P < 0.001.P值通过Wilcoxon秩和检验计算。(g) Violin图显示了TCGA队列中CSCC和CAde的细胞毒性评分。∗P < 0.05.P 值由 Wilcoxon Rank Sum Test 计算得出。(h）基于细胞毒性基因特征的总生存期 Kaplan-Meier 曲线。P 值通过对数秩检验计算。(i）髓样细胞的 t-SNE 图，按细胞类型着色。(j）八个样本中每个巨噬细胞亚群的比例。(k）点阵图描述了每个已识别的巨噬细胞亚簇的富集 GO 项。(l）热图显示了基于已知基因特征的每个巨噬细胞亚簇的功能活性得分。(m）小提琴图描述了 CSCC 和 CAde 的吞噬得分。∗∗∗P < 0.001.P 值通过 Wilcoxon 秩和检验计算。(n）收集的 CSCC（n = 32）和 CAde（n = 11）样本中具有吞噬功能的巨噬细胞的 mIF 染色。(o）框图显示 CSCC 和 CAde 中 Macro-C2 （MRC1+/CD68+）细胞/视野的数量。∗∗∗P < 0.001.P值通过Wilcoxon秩和检验计算。

与CAde相比，促进肿瘤生长的vCAF在CSCC中占优势

与CAde相比，CSCC中富含促进肿瘤生长的癌相关血管成纤维细胞（vCAFs）。研究人员通过mIF技术验证了这一发现，并从一个CSCC样本中提取和培养了原代成纤维细胞。通过流式细胞术，研究人员分离出了具有前瘤性的myoCAFs和vCAFs，并通过免疫荧光染色进一步验证了它们的存在。研究人员还通过转移实验发现，myoCAFs和vCAFs的细胞因子可以显著促进CSCC细胞的迁移能力。此外，研究人员还发现，与myoCAFs相比，vCAFs在促进血管生成方面具有更高的能力。

图3 CSCC 和 CAde 中间充质细胞的特征和亚群。(a-b）间质细胞的 t-SNE 图，分别按细胞类型和单个样本着色。(c）点阵图显示了已确定的间质细胞亚簇中标记基因的归一化表达水平。(d）根据基于 GSEA 结果的皮尔逊相关系数，确定了四个成纤维细胞亚簇。(e）成纤维细胞的 t-SNE 图分别按细胞类型（上）和可表达基因（下）着色。(f）点阵图显示了四个成纤维细胞亚群的 GO 富集项。(g）方框图显示 CSCC 和 CAde 中四个成纤维亚簇的组成比较。P值通过Wilcoxon秩和检验计算。(h-i）用 monocle 2 构建的成纤维细胞发育轨迹，分别按伪时间和病理类型着色。(j）伪时间热图显示了参与成纤维细胞发育过程的基因（左），并显示了不同成纤维细胞亚群基因组的富集 GO 项（右）。(k）伪时间热图显示了参与成纤维细胞发育过程的一些代表性 TFs 的动态变化。

图4 已鉴定的促肿瘤成纤维细胞的功能验证。(a）根据TCGA数据库中所有CC队列中的基因特征，myoCAFs（上）和vCAFs（下）的总生存期的Kaplan-Meier曲线。P值通过对数秩检验计算。(b-c）在收集的 CSCC（n = 32）和 CAde（n = 11）样本中，myoCAFs（上：POSTN+/COL1A1+）和 vCAFs（下：LMCD1+/COL1A1+）的 mIF 染色。∗P < 0.05，∗∗P < 0.001。P 值通过 Wilcoxon 秩和检验计算。(d）通过流式细胞术从一份临床 CC 样本中筛选出的 myoCAFs（上图：POSTN+/COL1A1+）和 vCAFs（下图：SOD2+/COL1A1+）的免疫荧光染色。(e-f）分别用不同条件培养基处理原代myoCAFs和vCAFs的CC细胞的Transwell迁移试验。Transwell 试验有三个独立的生物重复。∗∗∗P < 0.001.P 值通过 Wilcoxon 秩和检验计算。(g）用不同条件培养基处理原代 myoCAFs、vCAFs 或 Con 组 HUVEC 的血管形成检测。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，Ns 不显著。血管形成试验有三个独立的生物重复。P 值通过 Wilcoxon 秩和检验计算。(h）原代肌CAF和血管CAF中一些标记基因的mRNA表达水平。∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001。每个目标基因有三个独立的生物重复。P 值通过 Wilcoxon 秩和检验计算。

与预后相关的淋巴管内皮细胞（LEC）在 CSCC 中富集

研究人员通过单细胞RNA测序技术将6040个内皮细胞分为三个血管内皮细胞（vEC）亚群和一个淋巴管内皮细胞（LEC）亚群，并发现LEC在CSCC中比CAde中更为丰富。研究人员还通过免疫组化技术验证了这一发现。此外，研究人员还发现LEC在其他恶性肿瘤中具有促进远处转移和癌干细胞自我更新和发展的重要作用。研究人员进一步测量了四个亚型中一些已知基因标记的表达水平，发现LEC亚型中与血管生成相关的基因和脂质代谢相关的基因表达上调，而与免疫激活和免疫调节相关的基因表达下调。

CSCC 和 CAde 恶性上皮细胞的转录异质性

通过单细胞RNA测序技术对CSCC和CAde恶性上皮细胞的转录异质性进行了分析。研究人员从5个CSCC样本和3个CAde样本中分别分离出单个细胞，进行RNA测序，并对其进行了系统的转录组学分析。研究发现，CSCC和CAde的转录异质性存在显著差异。具体而言，CSCC中富含具有前瘤性的myoCAFs和vCAFs，而CAde中则富含具有免疫抑制作用的巨噬细胞。此外，研究人员还发现，CSCC中的CD8+T细胞具有更高的细胞毒性，但更低的疲劳程度，而CAde中则相反。

图5 CSCC 和 CAde 中恶性细胞的转录组异质性。(a-b）恶性上皮细胞的 t-SNE 图，分别按细胞簇和单个样本着色。(c）点阵图显示了各恶性细胞群的基因表达谱。(d）基于 GSVA 分析（MSigDB_C6）的热图显示了各恶性细胞群的分子功能。(e）方框图描述了 CSCC 和 CAde 中恶性细胞的干性得分。P值通过Wilcoxon秩和检验计算。(f) 从 CSCC 和 CAde 的 snRNA-seq 数据中识别出的与总生存期有关的差异表达基因的森林图。(g）收集的 CSCC（n = 32）和 CAde（n = 11）样本中 MTSS1 的代表性 IHC 染色。∗∗∗P < 0.001.P 值通过 Wilcoxon 秩和检验计算。(h) 收集的 CSCC（n = 32）和 CAde（n = 11）样本中 POLA1 的代表性 IHC 染色。∗∗∗P 0.25。P 值通过 Wilcoxon 秩和 t 检验计算。(m）某种药物在 CSCC 和 CAde 中切换点的散点图。某种药物的开关点小于 0.1 时定义为敏感性，CSCC 和 CAde 中药物的敏感性用颜色表示。将开关点值 0 转换为 0.009 以绘制图表。(n) 选定药物（嘧菌酯、拉帕替尼、达沙替尼和多拉帕莫德）在 CaSki 和 HeLa 细胞系中的 IC50 值。每种药物在每种细胞系中至少有三个生物重复。(o）用拉帕替尼和达沙替尼处理 CSCC 和 CAde 样品后，构建的类器官的形态变化。(p) CSCC 和 CAde 类器官中选定药物（嘧菌酯、拉帕替尼、达沙替尼和多拉帕莫德）的 IC50 值。每种药物在每个构建的类器官中至少有三个生物重复。

CSCC 和 CAde 中癌细胞与成纤维细胞之间的特殊细胞相互作用

研究人员使用CellphoneDB数据库中的一组配体-受体（L-R）对来预测九种主要细胞类型之间的潜在相互作用。结果显示，CAde中的相互作用对比CSCC更为丰富，尤其是上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用。然后，研究人员确定了属于CSCC和CAde的特定配体-受体对。有趣的是，研究人员发现CAde中的特定配体-受体对比CSCC中更多。大约68.5%的显著相互作用对被CAde和CSCC共享，而23.5%的相互作用对是CAde特有的。研究人员还通过转移实验发现，癌细胞和成纤维细胞的细胞因子可以显著促进CSCC和CAde细胞的迁移能力。此外，研究人员还发现，CSCC和CAde中的癌细胞与成纤维细胞之间存在不同的特定配体-受体对，如CSCC中的FN1-ITGA3和CAde中的NRG1-ERBB2。

图6 CSCC 和 CAde 中恶性细胞与成纤维细胞之间的特殊通讯模式。(a-b）CAde 和 CSCC 中主要细胞类型之间的细胞通讯格局。线条颜色代表主要细胞类型。(c）条形图显示了 CSCC 和 CAde 中主要细胞类型之间显著相互作用的数量。(d) 维恩图显示了 CSCC 和 CAde 中特定相互作用的数量。(e) 层次图显示了 CSCC 和 CAde 中源细胞和目标细胞之间选定相互作用对的交流可能性。(f）气泡图显示了 CSCC 和 CAde 中选定的癌细胞与成纤维细胞之间相互作用对的交流概率。(g）热图显示了癌细胞和鉴定出的 CAFs 中特定受体和配体的表达水平。(h）癌细胞和 CAFs 中 NRG1-ERBB2 相互作用的表达比率。(i）癌细胞和 CAF 中 FN1-ITGA3 相互作用的表达比率。

图7 本研究的主要内容分析和结论。

#4

总结

Suggestion

本文研究了宫颈鳞状细胞癌（CSCC）和腺癌（CAde）之间的异质性微环境和特定药物反应。与 CAde 相比，CSCC 中的 CD8+ T 细胞具有更强的细胞毒性，但耗竭率较低，而吞噬型 MRC1+ 巨噬细胞在 CSCC 中特别富集。CSCC中肿瘤相关肌成纤维细胞（myoCAFs）和肿瘤相关血管成纤维细胞（vCAFs）更为丰富，并在体外进一步验证了它们的促转移作用。此外，本研究还通过揭示恶性上皮细胞转录组的异质性，确定了一些针对CSCC（达沙替尼和多拉帕莫德）和CAde（嘧啶胺和拉帕替尼）的特异性化疗药物，并在细胞系和构建的CC衍生类器官中进一步验证了它们的特异性敏感性。细胞-细胞通讯网络显示，NRG1-ERBB2和FN1-ITAG3的通路分别对CAde和CSCC具有特异性，这可能部分解释了所发现的化疗药物的特异性。这些相互作用对CSCC和CAde的治疗提供了重要的参考价值，有助于制定更加有效的治疗方案。研究发现了一些特定的药物对CSCC和CAde具有不同的治疗效果，也为个性化治疗提供了新的思路。

参考信息

Single-nucleus RNA sequencing reveals heterogenous microenvironments and specific drug response between cervical squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.EBioMedicine. 2023 Oct 23:97:104846. doi: 10.1016/j.ebiom.2023.104846.PMID: 37879219 PMCID: PMC10618708.

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本文来源：类器官学社

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